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Aug 02, 2023

Antwort an: Antibiotika und hexagonale Ordnung in der bakteriellen Außenmembran

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4773 (2023) Diesen Artikel zitieren 861 Zugriffe auf 1 Altmetric Metrics-Details Der Originalartikel wurde am 9. August 2023 als Antwort auf G. Benn et al. veröffentlicht.

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4773 (2023) Diesen Artikel zitieren

861 Zugriffe

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Der Originalartikel wurde am 09. August 2023 veröffentlicht

Antwort auf G. Benn et al. Naturkommunikation https://doi.org/10.1038/s41467-023-40275-0 (2023)

Benn et al. kommentieren, dass die hexagonalen Gitter, die bei der Zugabe von Polymyxin in Flecken der äußeren Membran (OM) beobachtet werden, möglicherweise durch Proteine ​​der äußeren Membran (OMPs) gebildet werden. Sie gehen davon aus, dass Lipopolysaccharide (LPS) über die OMPs hinausragen, was die OMPs verbergen und verhindern könnte, dass sie durch AFM abgebildet werden. Darüber hinaus spekulieren sie, dass Polymyxin die LPS-Moleküle irgendwie ordnet, sodass das verborgene OMP-Gitter bei der Zugabe von Polymyxin sichtbar wird. Tatsächlich sind dies oder die Tatsache, dass Polymyxin andere biophysikalische Veränderungen an der Membran induziert, mögliche Szenarien, die sich aus unserer Studie1 ergeben könnten und weitere Untersuchungen erfordern, möglicherweise mit höheren zeitlichen oder räumlichen Bildgebungsmodalitäten.

Es ist seit Jahrzehnten bekannt, dass OMPs verschiedene dicht gepackte Anordnungen in Lipidmembranen zusammenbauen können, deren Geometrie von mehreren Parametern abhängt, darunter Lipidzusammensetzung, Elektrolyte und Inkubationsprotokoll2. Unsere Membranflecken von Außenmembranvesikeln (OMVs), die nativ aus Escherichia coli freigesetzt und mit hochauflösendem AFM abgebildet wurden, zeigen Regionen mit unterschiedlichen OMP-Dichten, d. h. mit dichter Ansammlung von OMPs, spärlicher Ansammlung von OMPs oder fast ohne OMPs ( Abb. 1a–f). Von solchen OMV-Membranen sowie von OmpF-Trimeren, die künstlich als kristalline Gitter in Phospholipidmembranen rekonstituiert wurden, kann man messen, dass OMPs mit ihren extrazellulären Domänen erheblich aus der Membranoberfläche herausragen, sodass sie direkt von der scannenden AFM-Spitze abgebildet werden können (Abb. 1). In unseren OMVs sind die dicht gepackten Regionen von OMPs seltener im Vergleich zu Regionen ohne OMPs, bei denen es sich vermutlich nur um Lipide handelt, da sie weniger hervorstehen als OMPs.

a–c AFM-Höhenbilder von OMVs, gesammelt aus E. coli, die OMPs überexprimieren. ein Übersichts-AFM-Höhenbild eines OMV, angereichert mit dem OMP Tsx8. Bei der Adsorption an Glimmer öffneten sich die OMVs als einschichtige Membranflecken. b Region aus (a), abgebildet mit höherer Auflösung. Die Membran enthält dicht verteilte Partikel, die aus der Membran herausragen. c Hochauflösendes Höhenbild, das OMPs (einzelne Vorsprünge) in dicht gepackten Anordnungen zeigt. d, e Übersicht AFM-Höhenbild eines OMV, angereichert mit dem OMP BamA9. Die dicht gepackten Bereiche von BamA erscheinen höher (gelb, Höhen von 10–15 nm) als die umgebende Membran (Höhen von 5–8 nm). f Extrazelluläre Oberfläche von OmpF-Trimeren in einer Membran, die Lipopolysaccharid (LPS) und E. coli-Lipide enthält7. g Extrazelluläre Oberfläche des Atommodells von OmpF-Trimeren, gerendert bei 3 Å (h, i) Hochauflösende AFM-Höhenbilder von 2D-Porin-OmpF-Gittern, zusammengesetzt in Lipidmembranen, die LPS und Phospholipide enthalten5. Die durch die langen OmpF-Schleifen gebildeten extrazellulären Domänen ragen 1,3 nm aus der Membran heraus. Dargestellt sind OmpF-Trimere, die in rechteckigen (h, 13,5 nm × 8,2 nm) oder trigonalen (i, 8,2 nm) Packungsanordnungen angeordnet sind. AFM-Bilder stellen Höhenbilder dar, die in Pufferlösung aufgenommen wurden. Der Helligkeitsbereich der AFM-Höhenbilder entspricht einem vertikalen Bereich von 16 nm (a), 4 nm (b), 1 nm (c), 30 nm (d, e), ≈ 1-2 nm (f) und 1,5 nm (h, i). Höhenbilder (f, h, i) werden als perspektivische Ansichten angezeigt. Maßstabsbalken: 200 nm (a), 50 nm (b) und 20 nm (c), 160 nm (d), 130 nm (e), 10 nm (f) und 5 nm (g–i). Die Bilder stammen aus (a–c) Ref. 8, (d, e) Ref. 9, (f) ref. 7 und (g–i) ref. 5.

Bei der Zugabe von Polymyxinen zu solchen OMV-Pflastern beobachteten wir, dass die meisten der großen Oberflächenbereiche, die zuvor leer waren, mit hexagonalen Gittern bedeckt wurden.

Diese Bildung erfolgt auf sehr ähnliche Weise, unabhängig von der OMP-Zusammensetzung der Membranflecken. Dies zeigen OMVs, die vom E. coli-Wildtyp-Stamm MG1655 (Abb. 2) gesammelt wurden, sowie OMVs vom E. coli-Stamm BL21(DE3)omp8, aus dem die am häufigsten vorkommenden OMPs, einschließlich OmpF, OmpC und andere, genetisch gelöscht wurden die gleichen Gitterstrukturen. Die OMV-Membranen des Stammes BL21(DE3)omp8 bestehen hauptsächlich aus Lipiden, wie aus niedrig- und hochauflösenden AFM-Höhenbildern hervorgeht (Abb. 1d, e) und im Einklang mit der hohen Fähigkeit dieses Stammes, überexprimierte OMPs3 einzubauen. Wir beobachten die gleichen Strukturen auch, wenn OMVs, die vom Stamm BL21(DE3)omp8 gesammelt wurden, spezifisch mit monomerem OmpG oder BamA angereichert werden. Daher scheint es für die Bildung hexagonaler Gitter nicht erforderlich zu sein, dass ein spezifisches OMP in großer Menge vorhanden ist. Es ist jedoch auch klar, dass die ursprünglich in der Membran vorhandenen OMPs irgendwie in die hexagonalen Gitter eingeschlossen werden, da wir bei der Zugabe von Polymyxin häufig ganze Membranbereiche beobachten, die von Gittern bedeckt sind (Abb. 2).

AFM-Höhenbilder mehrerer Membranen von OMVs, aufgenommen in Pufferlösung bei Raumtemperatur. Jede OMV-Membran ist vor und nach der Zugabe von Polymyxin dargestellt. Weiße Kästchen zeigen an, wo AFM-Höhenbilder aufgenommen wurden, um das Erscheinungsbild der Membranoberfläche bei höherer Auflösung zu zeigen. Das Fehlen struktureller Details weist darauf hin, dass die Membranregionen entweder keine OMPs enthielten und hauptsächlich Lipide enthielten oder dass OMPs nicht aufgelöst werden konnten. Ein Hinweis auf die Zugabe von Polymyxin zu OMV-Membranen ist, dass diese die Dicke verringern, die Oberfläche vergrößern und vollständig mit hexagonalen Gittern bedeckt sind. OMVs vom Stamm E. coli MG1655 WT, die AFM-Probenvorbereitung und die AFM-Bildgebung wurden wie beschrieben vorbereitet1. Der Helligkeitsbereich der AFM-Höhenbilder entspricht einem vertikalen Bereich von 18 nm (Übersichten) und 2 nm (Vergrößerungen). Maßstabsbalken, 200 nm (Übersichten) und 20 nm (Vergrößerungen).

Interessanterweise beobachten wir bei den Stämmen MG1655 ∆waaG und MG1655 ∆waaC, die eine veränderte LPS-, aber Wildtyp-Proteinzusammensetzung aufweisen, im Vergleich zum Wildtyp-MG1655 Veränderungen in den Polymyxin-induzierten Kristallstrukturen. Wenn es sich bei dem Gitter tatsächlich um OMPs handelt, wird ihre genaue Anordnung durch die LPS-Moleküle vermittelt und für die wohlgeordneten hexagonalen Gitter ist Wildtyp-LPS erforderlich. Außerdem sind in diesen Stämmen die Polysaccharide genetisch verkürzt, in Abwesenheit von Polymyxin wird jedoch kein Gitter beobachtet.

In Bezug auf das von Benn et al. vorgeschlagene Alternativmodell müssen mehrere Punkte geklärt werden: Erstens: Wie ist die Tarnung von OMP-Gittern durch LPS möglich? LPS müssten höher hervorstehen als die OMPs, aber bereits in Abwesenheit von Polymyxin beobachten wir und andere, dass OMPs höher hervorstehen als die abgebildete Membranoberfläche ohne OMPs.

Welche Identität hat außerdem das OMP, das die verborgenen Gitter bildet? Es scheint unwahrscheinlich, dass es sich dabei um OmpF-Gitter handelt. OmpF-Trimere können verschiedene Gitter aufbauen, von denen das hexagonale eine Periodizität von 8–9 nm aufweist2,4. Die Bildgebung von trimerem OmpF, das in Lipidmembranen oder OMVs rekonstituiert wurde, bei ausreichend gut angepassten AFM-Bildgebungsbedingungen kann eine Auflösung liefern, die eine eindeutige Anpassung der Röntgenstruktur ermöglicht (Abb. 1f – i). Die Trimeren zeigen durchweg große extrazelluläre Domänen, die etwa 0,8–1,3 nm aus der Membranoberfläche herausragen und in Abständen von etwa 4 nm erscheinen4,5,6,7. Während einige der Gitterparameter übereinstimmen, stimmen einige andere Parameter überhaupt nicht überein. Die Gitter wurden auch im E. coli-Stamm BL21(DE3)omp8 beobachtet, der kein OmpF enthält.

Wie wird außerdem das Gitter bei Stämmen mit stark verkürztem LPS verborgen? Die Stämme MG1655 ∆waaG und MG1655 ∆waaC haben Polysaccharidketten, die so kurz sind, dass man sich kaum vorstellen kann, wie sie ganze OMPs abdecken können.

Und schließlich: Wie veranlasst die Zugabe von Polymyxin das LPS, die Gitter freizulegen?

Insgesamt scheint es, dass es noch viel zu lernen über die Ultrastruktur der bakteriellen Außenmembranen und ihre Wechselwirkungen mit lipidzielenden Antibiotika gibt.

Aus verschiedenen E. coli MG1655-Stämmen hergestellte OMVs wurden 15 Minuten lang in DPBS-Puffer bei Raumtemperatur auf frisch gespaltenem Glimmer adsorbiert. Nach der Adsorption wurde die Probe fünfmal vorsichtig mit frischem DPBS-Puffer gewaschen, um nicht adsorbierte OMVs zu entfernen. Anschließend wurden OMVs mithilfe eines auf Kraft-Abstands-Kurven basierenden AFM (FD-basiertes AFM) abgebildet, das mit einem AFM (Nanoskop Multimode 8, Bruker) durchgeführt wurde, das im PeakForce Tapping-Modus in Pufferlösung (DPBS) bei Raumtemperatur betrieben wurde. Das AFM war mit einem 120 μm piezoelektrischen Scanner und einer Flüssigkeitszelle ausgestattet. Die Bilder wurden mit zwei verschiedenen AFM-Cantilevern aufgenommen: PEAKFORCE-HiRs-F-A (Bruker) mit einer nominalen Federkonstante von 0,4 N/m, einer Resonanzfrequenz von ≈165 kHz in Flüssigkeit und einer geschärften Siliziumspitze mit einem nominalen Radius von ≈1 nm oder SCANASYST-FLUID + (Bruker) mit einer nominellen Federkonstante von 0,7 N/m, einer Resonanzfrequenz von ≈150 kHz in Flüssigkeit und einer geschärften Siliziumspitze mit einem nominellen Radius von ≈2 nm. Vor der Bildgebung wurden die Ausleger durch Rampen auf der Glimmeroberfläche und die thermische Abstimmungsmethode kalibriert. Die Bilder wurden mit einer Oszillationsfrequenz von 2 kHz unter Anwendung einer Abbildungskraft von 100–120 pN und einer vertikalen Amplitude von 30 nm aufgenommen. Das AFM wurde in einer selbstgebauten akustisch isolierten und temperaturkontrollierten Box platziert. Die Bilder wurden im Zeitrahmen von Minuten gesammelt. Rohe AFM-Bilder wurden mit der AFM-Analysesoftware Nanscope v.1.8 zum Nivellieren und Glätten verarbeitet.

Diese Antwort enthält keine Originaldaten. Die angezeigten Daten wurden zuvor veröffentlicht und werden entsprechend referenziert.

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Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds über das Stipendium 187170 an SH und vom National Center of Competence in Research AntiResist (180541) unterstützt.

Department of Biosystems Science and Engineering, Eidgenössische Technische Hochschule (ETH) Zürich, Mattenstrasse 26, 4058, Basel, Switzerland

Selen Manioglu & Daniel J. Müller

Biozentrum, Universität Basel, Spitalstrasse 41, 4056, Basel, Schweiz

Seyed Majed Modaresi & Sebastian Hiller

Abteilung für Chemie und Molekularbiologie, Universität Göteborg, Göteborg, 405 30 Göteborg, Schweden

Johannes Thoma

Labor für Physikalische Chemie, ETH Zürich, 8093, Zürich, Schweiz

Sarah A. Overall und Alexander B. Barnes

Spexis AG, 4123, Allschwil, Switzerland

Gregory Upert & Daniel Obrecht

Bachem AG, 4416, Bubendorf, Schweiz

Anatol Luther

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SM, SMM, JT, SO, GU, AL, AB, DO, DM und SH trugen gleichermaßen zur Interpretation der Ergebnisse und zum Verfassen des Manuskripts bei.

Korrespondenz mit Daniel J. Müller oder Sebastian Hiller.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Manioglu, S., Modaresi, SM, Thoma, J. et al. Antwort an: Antibiotika und hexagonale Ordnung in der bakteriellen Außenmembran. Nat Commun 14, 4773 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40276-z

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Eingegangen: 31. Januar 2023

Angenommen: 19. Juli 2023

Veröffentlicht: 09. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40276-z

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