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Jul 31, 2023

Struktureller Mechanismus des Umbaus der Mitochondrienmembran durch menschliches OPA1

Nature Band 620, Seiten 1101–1108 (2023)Diesen Artikel zitieren 3393 Zugriffe auf 45 Altmetric Metrics-Details Eindeutige Morphologien des mitochondrialen Netzwerks unterstützen unterschiedliche Stoffwechsel- und Regulierungsfunktionen

Nature Band 620, Seiten 1101–1108 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Unterschiedliche Morphologien des mitochondrialen Netzwerks unterstützen unterschiedliche Stoffwechsel- und Regulierungsprozesse, die die Zellfunktion und das Schicksal bestimmen1,2,3. Die mechanochemische GTPase optic atrophy 1 (OPA1) beeinflusst die Architektur von Cristae und katalysiert die Fusion der mitochondrialen Innenmembran4,5. Trotz seiner grundlegenden Bedeutung sind die molekularen Mechanismen, durch die OPA1 die mitochondriale Morphologie moduliert, unklar. Mithilfe einer Kombination aus Zell- und Strukturanalysen beleuchten wir hier die molekularen Mechanismen, die für die OPA1-abhängige Membranumgestaltung und -fusion von entscheidender Bedeutung sind. Menschliches OPA1 bettet sich über eine Lipid-bindende Paddle-Domäne in Cardiolipin-haltige Membranen ein. Eine konservierte Schleife innerhalb der Paddle-Domäne dringt tief in die Doppelschicht ein und stabilisiert die Wechselwirkungen mit Cardiolipin-angereicherten Membranen weiter. Die Dimerisierung von OPA1 durch die Paddle-Domäne fördert die helikale Anordnung eines flexiblen OPA1-Gitters auf der Membran, das die Mitochondrienfusion in Zellen vorantreibt. Darüber hinaus erfährt das membranbiegende OPA1-Oligomer Konformationsänderungen, die die membraneinführende Schleife aus dem äußeren Blättchen herausziehen und zur Mechanik des Membranumbaus beitragen. Unsere Ergebnisse liefern einen strukturellen Rahmen für das Verständnis, wie menschliches OPA1 die mitochondriale Morphologie prägt, und zeigen uns, wie menschliche Krankheitsmutationen die Funktionen von OPA1 beeinträchtigen.

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Alle 3D-Kryo-EM-Daten, die die Ergebnisse dieser Studie unterstützen, wurden in der Electron Microscopy Data Bank unter den Zugangscodes EMD-26977 und EMDB-26984 hinterlegt. Die Modellkoordinaten wurden im PDB unter den Zugangscodes 8CT1 und 8CT9 hinterlegt. Proteinsequenzdaten für Sequenz-Alignments sind bei UniProt erhältlich (Zugangscodes finden Sie in den Abbildungslegenden). Die in dieser Studie verwendeten OPA1-Sequenzen sind wie folgt: Mensch (UniProt: O60313), Chlorocebus sabaeus (grüne Meerkatze; UniProt: A0A0D9R952), Macaca mulatta (Rhesusaffen; UniProt: F6Y1N8), Pan troglodytes (Schimpanse; UniProt: A0A2I3SKT2), ​​Gorilla Gorilla (Gorilla; uniprot: g3s1u3), paniscus (bonobo; uniprot: a0a2r9bdg8), papio anubis (pavian; uniprot: a0a096n399), callithrix jacchus (marmoset; uniprot: a0Ar2r8pc53) oder marmoset; : G1tab7), ictidomys tridecemlineatus (Eichhörnchen; UniProt: I3MI89), Cavia porcellus (Meerschweinchen; UniProt: H0V6M3), Mus musculus (Maus; UniProt: P58281), Rattus norvegicus (Ratte; UniProt: Q2TA68), Canis Familiaris (Hund, UniProt: F1PK93), Vulpes vulpes (Rotfuchs, UniProt: A0A3Q7T0T6), Felis catus (Katze; UniProt: A0A337SN50), Ailuropoda melanoleuco (Katze; UniProt: G1MBN4), Sus scrofa (Schwein; UniProt: A0A5G2QQR2), Loxodonta africana (Afrikanischer Elefant; UniProt: G3SNG0 ), Equus caballus (Pferd; UniProt: F6Z2C8), Vicugna pacos (Alpaka; UniProt: A0A6I9I1B0), Bos taurus (Kuh; UniProt: E1BBC4), Capra hircus (Ziege; UniProt: A0A452EKR4), Ovis aries (Schaf; UniProt: A0A6P7D299), Desmodus rotundus (Vampirfledermaus; UniProt: K9J3D6), Tursiops truncatus (Delfin; UniProt: A0A2U4ACH9), Delphinapterus leucas (Beluga). Wal; UniProt: A0A2Y9MT19), Danio rerio (Zebrafisch; UniProt: Q5U3A7), Oncorhynchus masou (Lachs; UniProt: O93248), Gallus gallus (Huhn; UniProt: Q5F499) und Meleagris gallopavo (wilder Truthahn; UniProt: G3UT81). Vollständige Versionen aller Gele und Blots finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken L. Doan für die Reagenzvorbereitung; den Mitarbeitern des WM Keck Foundation Advanced Microscopy Laboratory der University of California, San Francisco, A. Myasnikov, D. Bulkley und Z. Yu für Hilfe bei der Datenerfassung; E. Paraskevi Tsiolaki für technische Unterstützung bei der Massenphotometrie; P. Thomas für rechnerische Unterstützung; E. Krause für seine Unterstützung bei der Zellsortierung; S. Jungbluth für die Aufnahme der TEM-Bilder von Zellen; G. Morgan und C. Ozzello für Schulung und Unterstützung im Bereich Elektronenmikroskopie; den Mitarbeitern der Shared Instrument Pool (SIP)-Kerneinrichtung (SCR_018986) der Abteilung für Biochemie der University of Colorado Boulder für die Nutzung der gemeinsamen Forschungsinstrumentierungsinfrastruktur; A. Erbse für Hilfe bei biophysikalischen Instrumenten und Unterstützung; die Mitglieder des Biofrontiers Advanced Light Microscopy Core für den Einsatz von Laser-Konfokalmikroskopen; J. Dragavon ​​für Schulung und Unterstützung; K. Luger und J. Rudolph für ihre Unterstützung und für die Bereitstellung des Mikroplatten-Lesegeräts für die fluoreszenzbasierten Tests; M. Ford, K. Faelber, V. Gama und C. Hayes für die Lektüre des Manuskripts; und O. Daumke sowie die Mitglieder der Labore Aydin und Kasinath für technische Beratung und Diskussionen. Diese Arbeit wurde teilweise durch das American Heart Association Postdoctoral Fellowship 23POST1020756 (an KEZ), den Webb-Waring Biomedical Research Award (HA) der Boettcher Foundation, ein Stipendium des National Institute of Health R35 GM150942 (an HA), die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Collaborative, unterstützt Forschungszentrum 894, Projekt A20 (an MvdL), ein National Institute of Health-Stipendium R01 GM127673 (an AF), ein Faculty Scholar Grant des HHMI (an AF) und ein QBI-FUN Collaborative Integrative Structural Biology Grant (an AF). AF ist ein ehemaliger Forscher des Chan Zuckerburg Biohub.

Medizinische Biochemie und Molekularbiologie, Zentrum für Molekulare Signalgebung, PZMS, Medizinische Fakultät der Universität des Saarlandes, Homburg, Deutschland

Alexander von der Malsburg & Martin van der Laan

Abteilung für Biochemie, University of Colorado Boulder, Boulder, CO, USA

Gracie M. Sapp, Kelly E. Zuccaro, Jeremy A. Bennett und Halil Aydin

Abteilung für Biochemie und Biophysik, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA

Alexander von Appen, Frank R. Moss III & Adam Frost

Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik, Dresden, Deutschland

Alexander von Appen

Altos Labs, Bay Area Institute of Science, San Francisco, Kalifornien, USA

Frank R. Moss III & Adam Frost

Institut für Physiologie, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA

Raghav Kalia

Institut für Bioingenieurwesen, School of Life Sciences, École Polytechnique Fédérale de Lausanne, Lausanne, Schweiz

Luciano A. Abriata und Matthew Dal Peraro

Protein Production and Structure Core Facility, School of Life Sciences, École Polytechnique Fédérale de Lausanne, Lausanne, Schweiz

Luciano A. Abriata

Schweizerisches Institut für Bioinformatik, Lausanne, Schweiz

Luciano A. Abriata und Matthew Dal Peraro

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, USA

Adam Frost

Quantitative Biosciences Institute, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA

Adam Frost

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AvdM klonte die siRNA-resistenten OPA1-Konstrukte und führte Experimente mit Säugetierzellkulturen durch, bereitete Proben für die In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung vor und führte Immunblot-Analysen, Bildgebung und Analysen durch. HA, GMS, KEZ und JAB führten Klonierung, Mutagenese, biochemische und biophysikalische Charakterisierungen, Negativfärbungs-EM, Kryo-EM-Experimente und -Analysen durch, bestimmten die Kryo-EM-Strukturen und führten Modellbildung, Verfeinerung und Validierung der Kryo-EM-Strukturen durch . LAA und MDP führten Molekulardynamiksimulationen und Datenanalysen durch. FRM unterstützte bei der Liposomenvorbereitung und Kryo-EM-Experimenten. AvA unterstützte bei der Probenvorbereitung und -analyse für die chemische Vernetzung. RK trug zur Kryo-EM-Bildanalyse, zum Modellaufbau und zu Diskussionen bei. MvdL, AvdM, AF und HA konzipierten und überwachten die Forschung. Alle Autoren analysierten die Daten, diskutierten die Ergebnisse und verfassten das Manuskript.

Korrespondenz mit Adam Frost oder Halil Aydin.

AF ist Aktionär und Mitarbeiter von Altos Labs sowie Aktionär und Berater von Relay Therapeutics. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature dankt Thomas Langer und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Unter Verwendung eines rekombinanten Escherichia coli-Expressionssystems exprimierten und reinigten wir menschliches S-OPA1 (Reste 252–960) in Gegenwart von Detergenzien durch Ni2+-Affinitäts- und Gelfiltrationschromatographie. a, Ein repräsentatives Größenausschlusschromatogramm des menschlichen S-OPA1. b: Gereinigte S-OPA1-Konstrukte auf einem mit Coomassie-Blau gefärbten SDS-PAGE-Gel. In technischer dreifacher Ausfertigung durchgeführt. c: Das massenphotometrische Profil von nukleotidfreiem menschlichem S-OPA1 zeigt eine scheinbare Molekülmasse von 82 σ 9,8 kDa, was einem Monomerzustand entspricht. d, Kyte- und Doolittle-Hydropathiediagramm der menschlichen OPA1-Isoform 1 in voller Länge. Hydrophobe Regionen, die der Transmembranregion (TM) und der Fusionsschleife entsprechen, sind blau bzw. rot hervorgehoben. Die rote Linie zeigt die Null-Basislinie auf der Hydropathie-Skala an. e, Um die ordnungsgemäße Faltung und nukleotidabhängige Dimerisierung von rekombinantem S-OPA1 zu beurteilen, inkubierten wir die Probe mit dem nicht hydrolysierbaren Analogon GMPPCP, Mg2+ und K+. Mithilfe der Negativfärbungs-Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) beobachteten wir dann, dass S-OPA1 über GTPase-Domänenwechselwirkungen Dimere bildet. Repräsentative Negativfärbungs-EM-2D-Klassendurchschnitte von menschlichem S-OPA1 aus den Negativfärbungsdaten, die mit einem Tecnai T12-Mikroskop mit CCD-Kamera gesammelt wurden, zeigen, dass Partikel wohldefinierte Formen mit modularer Domänenarchitektur haben. Monomeres menschliches S-OPA1 bildet G-Domänen-Dimere in Gegenwart des nicht hydrolysierbaren GTP-Analogons GMPPCP.

a, Repräsentative bewegungskorrigierte Elektronenmikroskopaufnahme von Membran-Nanoröhren-gebundenen S-OPA1-Filamenten. b, Galerie von 2D-Klassendurchschnitten, berechnet aus den Kryo-EM-Daten, die die S-OPA1-Monomere zeigen, die auf der Oberfläche von Cardiolipin-angereicherten Lipid-Nanoröhren angeordnet sind. c, g, Schnitte durch die ungeschärfte Dichtekarte auf verschiedenen Ebenen werden in der Draufsicht angezeigt. d, h, Winkelverteilung des membrangebundenen S-OPA1-Filaments für alle Partikelbilder, die in die Berechnung der endgültigen 3D-Rekonstruktion der membranproximalen (d) und der membrandistalen Konformation (h) einbezogen werden. e, i, Fourier-Shell-Koeffizientenkurven (FSC) (Schwellenwert 0,143) zwischen zwei unabhängig verfeinerten Halbkarten vor und nach der Nachbearbeitung. f, j, Endgültige 3D-Elektronendichtekarten beider Strukturen sind entsprechend der örtlichen Auflösung eingefärbt und werden in horizontalen und vertikalen Schnitten durch Kryo-EM-Dichten angezeigt. Die lokale Auflösung wurde von ResMap berechnet.

Einzelheiten finden Sie im Abschnitt Bildanalyse und 3D-Rekonstruktion der Methoden.

a, b: Chemische Vernetzung und Massenspektrometrie zeigen Karten der Protein-Protein-Interaktion (PPI) der menschlichen S-OPA1-Polymere. Kreisdiagramm, das die Verteilung der chemischen Vernetzungen von DSG (a) und DSS (b) zeigt, die auf menschliches OPA1 abgebildet sind, dargestellt als farbige Kreise mit markierten Aminosäurepositionen. Orange Balken zeigen die Positionen der Lysinreste an, und Vernetzungen, die die Lysinreste verbinden, werden durch schwarze Linien zwischen den entsprechenden Aminosäurepaaren dargestellt. c, Vernetzungen, die im S-OPA1-Polymer bei der Membranbindung entstehen (rot). Identifizierte intermolekulare Vernetzungen werden auf den S-OPA1-Untereinheiten abgebildet. CX-MS zeigt eine Anhäufung von Kontakten zwischen S-OPA1-Paddeldomänen, was auf starke Wechselwirkungen in der membrangebundenen Konformation hinweist. d, Querverbindungen zwischen allen OPA1-Domänen. Die Domänen sind nach Reihenfolge geordnet (farbige Blöcke). Die DSG- (rot) und DSS-Vernetzungen (blau), die die Abstandsbeschränkung (30 Å) erfüllen, werden auf die membrangebundene Kryo-EM-Struktur von menschlichem S-OPA1 abgebildet. In DSG- und DSS-Datensätzen identifizierte Querverbindungen werden in Lila angezeigt.

a: EM-Dichte des isolierten S-OPA1-Monomers aus nachbearbeiteten Karten, die die Qualität der Karte, den Aufbau und die Anpassung zeigt. Eine einzelne Ansicht der Kryo-EM-Dichte wird als halbtransparentes Netz dargestellt und dem Modell überlagert. Beispiele für die Modellanpassung innerhalb der durch den B-Faktor geschärften Kryo-EM-Dichte für die Alpha-Helices von S-OPA1 BSE (rot), Stiel (blau) und Paddel (grün) werden im Kontext des Atommodells mit Seitenketten gezeigt als Stöcke und das Rückgrat als Bänder. b: Eine vergleichende Analyse des menschlichen S-OPA1 mit Hefestrukturen, die in der PDB hinterlegt sind, unter Verwendung des topologieunabhängigen Vergleichsservers CLICK ergab, dass die S-OPA1-Struktur eine ähnliche Topologie für die GTPase-, BSE- und Stieldomänen aufweist; Allerdings nimmt die Paddeldomäne durch die Hinzufügung der α3P-Helix eine neuartige Architektur an, die die Bildung der Schnittstelle 7 erleichtert. Struktureller Vergleich der membrannahen Konformation von menschlichem S-OPA1 (beige) mit S. cerevisiae (Pink, PDB-ID: 6JSJ ) und C. thermophilum (Hellblau, PDB-ID: 6QL4) Mgm1-Kristallstrukturen. Insgesamt entspricht die membrannahe Konformation von menschlichem S-OPA1 und S. cerevisiae Mgm1 einem rmsd von 8,46 Å und von menschlichem S-OPA1 und C. thermophilum Mgm1 einem rmsd von 10,30 Å über alle Cα-Atome. c, Überlagerung der membrandistalen Konformation menschlicher Mgm1-Strukturen aus S-OPA1 (beige), S. cerevisiae (rosa) und C. thermophilum (hellblau). Insgesamt überlagert die membrandistale Konformation von menschlichem S-OPA1 die von S. cerevisiae Mgm1 und C. thermophilum Mgm1 mit einem rmsd von ~7,3 Å über alle Cα-Atome. d, Mehrfachsequenz-Alignment von menschlichem S-OPA1, S. cerevisiae S-Mgm1 und C. thermophilum S-Mgm1. Zwischen menschlichen Proteinen und Hefeproteinen besteht eine Sequenzkonservierung von ca. 21 %. Die meisten an der Bindung an Membranen beteiligten Reste sind nicht konserviert (hervorgehoben mit einem Sternchen).

Um weitere Einblicke in den molekularen Mechanismus des OPA1-vermittelten Membranumbaus zu gewinnen, haben wir die menschliche S-OPA1-Polymeranordnung in Gegenwart von GMPPCP und CL-angereicherten Membranen wiederhergestellt. Elektronenmikroskopische Aufnahmen mit negativer Färbung zeigen die Liposomenbindungs- und Remodellierungsaktivität von Wildtyp und mutiertem S-OPA1 auf Cardiolipin-angereicherten Liposomen und Membrannanoröhren. S-OPA1 bildet wohlgeordnete Filamente, die sich um Membrantubuli wickeln. Wildtyp- und mutierte Proteine ​​wurden vor der Gittervorbereitung vier Stunden lang bei Raumtemperatur mit Liposomen und Membran-Nanoröhren inkubiert. Mutationen an positiv geladenen und hydrophoben Resten innerhalb der Membranandockregion, der Membraninsertionsschleife (MIL), der membranzugewandten Oberfläche und der Schnittstelle 7 führten zu schwerwiegenden Defekten in der Membranbindungs- und Remodellierungsaktivität von menschlichem S-OPA1. Eingefügte Nahaufnahmen ausgewählter Liposomen und Membran-Nanoröhren. Die Bilder wurden in technischer Dreifachausfertigung aufgenommen. Maßstabsbalken, 100 nm.

a: Repräsentative SDS-PAGE-Gele, die die Sedimentation von S-OPA1 WT und Mutanten in Gegenwart und Abwesenheit von CL-angereicherten Liposomen zeigen. Die Proben stammten aus demselben Experiment und wurden unter Verwendung mehrerer Gele parallel analysiert. P, Pellet; S, Überstand; WT, Wildtyp; MIL, Membraneinführschlaufe. b, c, Gelquantifizierung, die die relative Menge an S-OPA1 (%) für Pellet- und Überstandsfraktionen ohne Liposomen (b) und mit Liposomen (c) in den Co-Sedimentationstests darstellt. Die Balkendiagramme stellen die Quantifizierung der Coomassie-gefärbten Proteinbanden aus drei biologischen Replikaten dar und werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Für jede S-OPA1-Variante wurden zweiseitige, ungepaarte t-Tests durchgeführt, bei denen Pellet und Überstand verglichen wurden. P < 0,0001 (****); P = 0,0002(***) oder P = 0,0003(***); P = 0,001 (**); P = 0,01 (*); ns, nicht signifikant.

Quelldaten

a, Fluoreszenzmikroskopische Bilder von Wildtyp- (WT), Membran-Docking- (K738E, R858E), Membran-Inserting-Loop- (W771A, W775A, L776A, K779E) und Krankheitsmutanten (R781E, R824E) in mitochondrialen Morphologieanalysen. HeLa-Zellen wurden 24 Stunden lang mit leerem Vektor (EV) oder den angegebenen siRNA-resistenten OPA1-Konstrukten transfiziert und dann 72 Stunden lang einer RNA-Interferenz unter Verwendung der angegebenen siRNAs ausgesetzt. Das mitochondriale Netzwerk wurde durch Anfärben des Außenmembranproteins TOMM22 (grün) sichtbar gemacht und co-transfiziertes mCherry-NLS (rot) wurde zur Identifizierung transfizierter Zellen verwendet. In biologischer Dreifachausfertigung durchgeführt. Maßstabsbalken, 20 µm. b: Expression und Stabilität der siRNA-resistenten OPA1-Proteine ​​wurden durch Immunoblot-Analyse von Triton für 72h. 20 µg pro Spur (n = 3 unabhängige Experimente). c, Quantifizierung von Mikroskopiebildern von Wildtyp, leerem Vektor (EV) und Mutanten. Mitochondriale Phänotypen, die in HeLa-Zellen beobachtet werden, die vorübergehend menschliche OPA1-Varianten exprimieren, wie in a beschrieben. Zellen, die die Kontroll-siRNA EV (n = 280), OPA1 siRNA EV (n = 269 Zellen), Wildtyp-OPA1 (n = 238 Zellen), OPA1 K738E (n = 235 Zellen), OPA1 W771A (n = 281 Zellen) exprimieren. , OPA1 W775A (n = 264 Zellen), OPA1 W776A (n = 255 Zellen), OPA1 K779E (n = 282 Zellen), OPA1 R858E (n = 245 Zellen), OPA1 R781E (n = 262 Zellen) und OPA1 R824E ( n = 283 Zellen) über drei experimentelle Replikate. Datenpunkte stellen den durchschnittlichen Prozentsatz der Zellen über drei experimentelle Replikate dar. Fehlerbalken zeigen sem d, menschliche OPA1-Mutationen im Zusammenhang mit Optikusatrophie, Kleinhirnataxie und anderen Krankheiten, die als feste Kugeln auf der Paddeldomäne von OPA1 abgebildet und nummeriert sind. Rück- und Seitenansicht der molekularen Struktur des menschlichen S-OPA1 LBD (grün gefärbt).

Quelldaten

a: Die mitochondriale Oberfläche (μm2) wurde aus ultradünnen Schnitten von Zellen berechnet, die mit Kontroll-siRNA-Leervektor (EV) (n = 312), OPA1-siRNA-EV (n = 444), OPA1-WT (n = 543), OPA1-Membran transfiziert wurden. Inserting-Loop-Mutante (MIL) (n = 523) und OPA1 K819E (n = 516). Der Standardfehler des Mittelwerts wird mit dem Mittelwert jedes Datensatzes angegeben (n = 3 technische Dreifachausfertigungen). Aufgrund der Variation der Zahlen für jeden Datensatz wurde ein zweiseitiger statistischer Mann-Whitney-Test verwendet, um die statistische Signifikanz zwischen Kontroll-siRNA-EV und jeder anderen Probe zu berechnen. P < 0,0001 (****). b, Quantifizierung der Anzahl der Cristae pro Mitochondrium. Die mittlere Anzahl der Cristae wurde mit dem Standardfehler des Mittelwerts für jede Probe berechnet und angegeben (n = 3 technische Dreifachbestimmungen). Die Kontroll-siRNA-EV und andere Proben wurden einem zweiseitigen Mann-Whitney-Test unterzogen, um die statistische Signifikanz zu bestimmen. P = 0,0176 (*); P < 0,0001 (****). c, Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie in WT- und mutierten OPA1-Zellen. Die mitochondriale Form wurde vier verschiedenen Klassen zugeordnet: oval, ellipsoid, vieleckig oder länglich, und die relative Verteilung jeder Form wurde als Balkendiagramm dargestellt. Der Prozentsatz jeder Form wird für jede Probe angegeben. d, Quantifizierung der Cristae-Morphologie in WT- und mutierten OPA1-Zellen. Ein Balkendiagramm, das die Verteilung von vier verschiedenen Cristae-Morphologien (normal, geschwollen, kurz oder ungeordnet) darstellt, die in den jeweiligen Proben in Prozenten beobachtet wurden. e: Repräsentative TEM-Bilder des Mitochondriums, die verschiedene Arten der Cristae-Morphologie zeigen, die vier Klassen zugeordnet sind: normal, geschwollen, kurz und gestört. Die Bilder wurden in technischer Dreifachausfertigung aufgenommen. Maßstabsbalken, 500 nm.

Quelldaten

a: Repräsentative Fluoreszenzmikroskopbilder zeigen die Co-Lokalisierung von mit Alexa Fluor 488 markiertem WT S-OPA1 auf den Texas Red-DHPE-haltigen Liposomen nach etwa 30 Minuten. Experimente in technischer Dreifachausfertigung durchgeführt. Maßstabsbalken, 0,5 µm. b, Membrandeformationstests mit WT S-OPA1 und Liposomen mit 0,25 % Nilrot; n = 5 biologisch unabhängige Experimente und ausgedrückt als Mittelwert, Fehlerbalken als ± Standardabweichung. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung eines ungepaarten zweiseitigen Student-t-Tests (P = <0,0001, ****) durchgeführt und der Grubbs-Test entfernte einen Ausreißer aus jeden Datensatz. vgl. Negativfärbungs-TEM-Analyse von Membranrekonstitutionstests mit c, S-OPA1 allein; d, Liposomen mit 0,25 % Nilrot allein; e, BSA mit Liposomen, die 0,25 % Nilrot enthalten; und f, WT S-OPA1 mit Liposomen, die 0,25 % Nilrot enthalten. g, Membrandeformationsassay mit WT S-OPA1 und Liposomen mit 1 % NBD-PC; n = 5 biologisch unabhängige Experimente und ausgedrückt als mittlere Fehlerbalken als ± Standardabweichung. Ein ungepaarter zweiseitiger Student-t-Test wurde mit dem NBD-PC-Datensatz durchgeführt (P = <0,0001, ****). h, Liposomen mit 1 % NBD-PC allein; i, BSA mit Liposomen, die 1 % NBD-PC enthalten; und j, WT S-OPA1 mit Liposomen, die 1 % NBD-PC enthalten. Eingefügte Nahaufnahme ausgewählter Liposomen aus TEM-Bildern mit Negativfärbung. Maßstabsbalken, 100 nm. Es wurde vorgeschlagen, dass die Störungen der äußeren Blättchen von CL-haltigen großen unilamellären Vesikeln (LUV) zu einer Vesikelfusion führen82. Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Fluoreszenzmikroskopie haben darüber hinaus gezeigt, dass die Inkubation von Hefe S-Mgm1 mit markierten Liposomen zu einer erhöhten Membranrauheit auf der Oberfläche von Liposomen führt37. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass das Hefeortholog Mgm1 möglicherweise einen ähnlichen Mechanismus zur Störung der Membraneigenschaften nutzt. Zusammengenommen legen unsere strukturellen und funktionellen Analysen nahe, dass OPA1-vermittelte Störungen der Blättchen die Membranumgestaltungsaktivität des Proteins unterstützen. Wir weisen darauf hin, dass diese Schlussfolgerungen auf unserem aktuellen Strukturwissen basieren und sich auf Lipide in synthetischen Membranen und Rekonstitutionstests in vitro beschränken. Inwieweit diese Erkenntnisse auf den Umbau der Mitochondrienmembran in menschlichen Zellen anwendbar sind, bleibt unklar. Unsere Arbeit bildet die Grundlage für die weitere Untersuchung der komplexen Mechanismen, die die Morphologie und Funktion der Mitochondrien regulieren.

Quelldaten

Ergänzende Abbildungen. 1–9 und Ergänzungstabelle 1.

Rohdaten hinter der ergänzenden Abbildung 3f.

Rohdaten hinter der ergänzenden Abbildung 4f.

Rohdaten hinter MitoSegNet-Segmentierungsanalysen in ergänzender Abbildung 5.

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Nachdrucke und Genehmigungen

von der Malsburg, A., Sapp, GM, Zuccaro, KE et al. Struktureller Mechanismus des Umbaus der Mitochondrienmembran durch menschliches OPA1. Natur 620, 1101–1108 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06441-6

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Eingegangen: 22. August 2022

Angenommen: 14. Juli 2023

Veröffentlicht: 23. August 2023

Ausgabedatum: 31. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06441-6

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